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Molekulargewicht: 496,99 WZ4003 ist ein hochspezifischer NUAK-Kinase-Inhibitor mit IC50 von 20 nM bzw. 100 nM für NUAK1 und NUAK2, ohne signifikante Hemmung von 139 anderen Kinasen.
In HEK- 293-Zellen, die Wildtyp-NUAK1, WZ4003 (3–10 μM) exprimieren, supprimieren deutlich die NUAK1-vermittelte MYPT1-Phosphorylierung. Darüber hinaus hemmt WZ4003 (10 μM) die MYPT1-Ser445-Phosphorylierung sowie die Zellmigration, -invasion und -proliferation in einem ähnlichen Ausmaß wie Knock-out in MEFs oder Knock-down in U2OS-Zellen von NUAK1. WZ4003 weist auch eine hohe spezifische Affinität zum L858R/T790M-mutanten EGFR auf, während es eine signifikant reduzierte zelluläre IC50 gegen T790M enthaltende Ba/F3-Zellen aufweist.
Protokoll (nur als Referenz) Kinase-Assay: [1]
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IC50 determination
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Active GST–NUAK1, GST–NUAK1[A195T] and GST–NUAK2 enzymes are purified using glutathione–Sepharose from HEK-293 cell lysates 36–48 h following the transient transfection of pEBG2T mammalian constructs expressing N-terminal GSTtagged NUAK1, NUAK1[A195T] or NUAK2. For peptide kinase assays, 96-well plates are used, and each reaction is performed in triplicate. Each reaction is set up in a total volume of 50 μL containing 100 ng of NUAK1 (wild-type or A195T mutant) or NUAK2 in 50 mM Tris/HCl (pH 7.5), 0.1 mM EGTA, 10 mM magnesium acetate, 200 μM Sakamototide, 0.1 mM [γ -32P]ATP (450–500 c.p.m./pmol) and the indicated concentrations of inhibitors dissolved in DMSO. After incubation for 30 min at 30°C, reactions are terminated by adding 25 mM (final) EDTA to chelate the magnesium. Then, 40 μL of the reaction mix is spotted on to P81 paper and immersed in 50 mM orthophosphoric acid. Samples are washed three times in 50 mM orthophosphoric acid followed by a single acetone rinse and air drying. The incorporation of [γ -32P]ATP into Sakamototide is quantified by Cerenkov counting. The values are expressed as a percentage of the DMSO control. IC50 curves are developed and IC50 values are calculated using GraphPad Prism software.
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Zellassay: [1]
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Cell lines
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U2OS cells, and MEFs
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Concentrations
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~10 μM
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Incubation Time
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5 days
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Method
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Cell proliferation assays are carried out colorimetrically in 96-well plates using the CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit following the manufacturer`s protocol. Initially, 2000 cells per well are seeded for U2OS cells and 3000 cells per well are seeded for MEFs. The proliferation assays are carried out over 5 days in the presence or absence of 10 μM WZ4003.
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Umrechnung verschiedener Modelltiere basierend auf BSA (Wert basierend auf Daten aus FDA Draft Guidelines)
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Species
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Baboon
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Dog
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Monkey
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Rabbit
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Guinea pig
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Rat
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Hamster
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Mouse
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Weight (kg)
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12
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10
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3
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1.8
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0.4
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0.15
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0.08
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0.02
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Body Surface Area (m2)
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0.6
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0.5
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0.24
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0.15
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0.05
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0.025
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0.02
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0.007
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Km factor
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20
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20
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12
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12
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8
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6
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5
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3
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Animal A (mg/kg) = Animal B (mg/kg) multiplied by
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Animal B Km
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Animal A Km
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Um beispielsweise die Resveratrol-Dosis für eine Maus (22,4 mg/kg) auf eine Dosis basierend auf dem BSA für eine Ratte zu ändern, multiplizieren Sie 22,4 mg/kg mit dem Km-Faktor für eine Maus und dividieren Sie dann durch den Km-Faktor für eine Ratte. Diese Berechnung ergibt eine Ratten-Äquivalentdosis für Resveratrol von 11,2 mg/kg.
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Rat dose (mg/kg) = mouse dose (22.4 mg/kg) ×
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mouse Km(3)
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= 11.2 mg/kg
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rat Km(6)
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Chemische Informationen
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Molecular Weight (MW)
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496.99
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Formula
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C25H29ClN6O3
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CAS No.
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1214265-58-3
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Storage
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3 years -20℃Powder
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6 months-80℃in solvent (DMSO, water, etc.)
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Synonyms
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N/A
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Solubility (25°C) *
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In vitro
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DMSO
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7 mg/mL
(14.08 mM)
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Water
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<1 mg/mL
(
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Ethanol
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<1 mg/mL
(
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* <1 mg/ml means slightly soluble or insoluble.
* Please note that Selleck tests the solubility of all compounds in-house, and the actual solubility may differ slightly from published values. This is normal and is due to slight batch-to-batch variations.
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Chemical Name
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Propanamide, N-[3-[[5-chloro-2-[[2-methoxy-4-(4-methyl-1-piperazinyl)phenyl]amino]-4-pyrimidinyl]oxy]phenyl]-
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Molaritätsrechner Verdünnungsrechner Molekulargewichtsrechner
Produktgruppe : PI3K/Akt/mTOR > AMPK-Inhibitor
