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Molekulargewicht:
516,65 Hesperadin hemmt Aurora B mit einem IC50 von 250 nM. Es reduziert deutlich die Aktivität von AMPK, Lck, MKK1, MAPKAP-K1, CHK1 und PHK, während es die MKK1-Aktivität in vivo nicht hemmt.
Biologische Aktivität Hesperadin hemmt die Fähigkeit von immunpräzipitiertem Aurora B, Histon H3 mit einer IC50 von 250 nM . zu phosphorylieren und reduziert deutlich die Aktivität anderer Kinasen (AMPK, Lck, MKK1, MAPKAP-K1, CHK1 und PHK) bei einer Konzentration von 1 &mgr;M. Im Gegensatz dazu reichen nur 20-100 nM Hesperadin aus, um den Verlust der mitotischen Histon-H3-Ser10-Phosphorylierung in HeLa-Zellen zu induzieren. Die Behandlung mit Hesperadin verursacht Defekte in der Mitose und Zytokinese, was zu einem Stopp der Proliferation von HeLa-Zellen und Polyploidisierung führt, was spezifisch auf die Hemmung der Aurora B-Funktion während des Prozesses der Chromosomenanheftung zurückgeführt werden kann. Hesperadin (100 nM) überwindet schnell den durch Taxol oder Monastrol, aber nicht durch Nocodazol induzierten Mitosestopp. Die Behandlung mit Hesperadin und Nocodazol in HeLa-Zellen beseitigt die Kinetochor-Lokalisierung von BubR1 und verringert die Intensität von Bub1 an den Kinetochoren, was darauf hindeutet, dass die Aurora B-Funktion für eine effiziente Kinetochor-Rekrutierung von BubR1 und Bub1 erforderlich ist, die wiederum für eine verlängerte Checkpoint-Signalgebung erforderlich sein könnte. Hesperadin verhindert die Phosphorylierung von rekombinantem Trypanosom-Histon H3 durch die T. brucei Aurora-Kinase-1 (TbAUK1) aus pathogenem Trypanosoma brucei mit IC50 von 40 nM in vitro-Kinase-Assays. Hesperadin hemmt das Zellwachstum von kultivierten infektiösen Blutstromformen (BF) mit einem IC50 von 48 nM signifikant und hemmt das Zellwachstum von prozyklischen Formen (PF) im Insektenstadium mit einem IC50 von 550 nM nur schwach.
Der Aurora B-Kinase-Assay Für den Aurora B-Kinase-Assay werden HeLa-Zellen in einem Puffer mit 50 mM NaCl lysiert. Der Ganzzellextrakt wird bei 13.000 U/min 20 Minuten lang bei 4 °C unter Verwendung einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Das aus 200 mg Ganzzellextrakt gewonnene Pellet wird erneut in 15 ml Lysepuffer mit 250 mM NaCl extrahiert, um aktive Aurora B-Kinase aus mitotischem Chromatin zu erhalten. Der Überstand mit niedriger Geschwindigkeit des letzteren Extrakts wird zur Immunpräzipitation verwendet. Monoklonales Maus-Anti-AIM-1 oder Maus-Anti-HA wird an GammaBind Plus Sepharose gekoppelt, und die Kügelchen werden im Extrakt 90 Minuten lang bei 4 °C über das Ende gedreht. Die Kügelchen werden gewaschen, aliquotiert und in Kinasepuffer (20 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 10 mM NaF) gewaschen. Der Kinase-Assay wird mit 10 µL Kügelchen in 20 µL Kinasepuffer mit 5 µg Histon H3, 10 µM ATP, 2,5 µCi [γ-32P]ATP und verschiedenen Konzentrationen von Hesperadin für 20 Minuten bei 37 °C durchgeführt. SDS-Probenpuffer wird hinzugefügt, und die Proben werden gekocht und durch SDS-PAGE aufgelöst. Das Gel wird getrocknet und das radioaktive Signal wird durch PhosphorImager-Analyse nachgewiesen. Die Daten werden mit der ImageQuant-Software analysiert. Methode Zellen werden für 24 und 48 Stunden unterschiedlichen Konzentrationen von Hesperadin ausgesetzt. Zu den angegebenen Zeitpunkten werden methanolfixierte Zellproben mit PBS gewaschen und anschließend in PI-Puffer (50 µg/ml Propidiumiodid, 10 mM Tris, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 200 µg/ml RNase A) für 20-40 . gefärbt Minuten bei 37 °C. Der DNA-Gehalt wird durch Durchflusszytometrie bestimmt.
Produktgruppe : Epigenetik > Aurora-Kinase-Inhibitor
