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Molekulargewicht:
503,48 NVP-BHG712 ist ein spezifischer EphB4-Inhibitor mit einer ED50 von 25 nM, der zwischen VEGFR- und EphB4-Hemmung unterscheidet; zeigt auch Aktivität gegen c-Raf, c-Src und c-Abl mit IC50 von 0,395 μM, 1,266 μM bzw. 1,667 μM.
Biologische Aktivität NVP-BHG712-Behandlung führt auch dosisabhängig zur Hemmung der RTK-Autophosphorylierung bei stabil transfizierten A375-Melanomzellen mit EC50 von 25 nM und 4,2 μM für EphB4 bzw. VEGFR2. In einem Wachstumsfaktor-induzierten Angiogenese-Modell unterdrückt NVP-BHG712 (3 mg/kg, po) signifikant die VEGF-stimulierte Gewebebildung und Vaskularisierung, indem es die EphB4-Weiterleitungssignale hemmt. Darüber hinaus kehrt NVP-BHG712 (10 mg/kg/kg, po) die VEGF-verstärkte Gewebebildung und das Gefäßwachstum wirksam um. NVP-BHG712 (3 mg/kg, po) zeigt eine lang anhaltende Exposition mit Konzentrationen um 10 μM im Plasma sowie in Lungen- und Lebergewebe für bis zu 8 Stunden und führt somit zu einer lang anhaltenden Hemmung der EphB4-Kinase-Aktivität in Mäuse.
In-vitro-Kinase-Assays Alle In-vitro-Kinase-Assays werden mit rekombinanten gereinigten Kinasen durchgeführt, die entweder von externen Anbietern gekauft oder im eigenen Haus hergestellt werden. Um die Kinaseaktivität abzuschätzen, werden sowohl der TR-FRET-basierte LanthaScreenTM als auch der Caliper Mobility Shift verwendet. Kurz gesagt basiert die LanthaScreenTM Assay-Technologie auf der Unterscheidung zwischen dem unphosphorylierten Substrat und dem phosphorylierten Produkt durch einen phosphospezifischen Antikörper, der nur an die phosphorylierte Version des Substrats bindet. Sowohl Antikörper als auch Substrat tragen fluoreszierende Markierungen und die unmittelbare Nähe der Markierungen in dem gebildeten Komplex ermöglicht die Messung eines Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-(FRET)-Signals. Das zeitabhängige/zeitgesteuerte Ablesen des FRET-Signals verbessert die Testleistung weiter, indem es die Hintergrundfluoreszenz reduziert. Für Dosis-Wirkungs-Messungen wird NVP-BHG712 in 90 % DMSO vorverdünnt und 50 nL der Verbindungslösungen werden mit einem HummingBird-Nanodispenser direkt in die leere Assay-Platte gegeben. Die Kinasereaktionen werden durch Zugabe von 4,5 µL ATP-Lösung (4 µM ATP, 20 mM Tris/HCL, 1 mM DTT, 0,03 % Tween20, 0,01 mM Na3VO4) und 4,5 µL Enzym/Substrat-Mix (100 nM Fluorescein poly-GAT) gestartet. , 0,5 % Rinderserumalbumin, 20 mM Tris/HCL, 1 mM DTT, 0,03 % Tween20, 0,01 mM Na3VO4). Weitere Bestandteile des Enzym/Substrat-Mixes sind die Enzyme sowie MgCl2/MnCl2, die spezifisch auf die Bedürfnisse des einzelnen Enzyms abgestimmt sind. Nach 60-minütiger Inkubation bei rt werden die Kinasereaktionen durch Zugabe von 4,5 µl Stopplösung (50 mM EDTA pH 8,0, 0,04 % NP-40, 20 mM Tris/HCl pH 7,4) gefolgt von 4,5 µl Detektionsmix (1,72 µg .) gestoppt /ml Tb-PY20-Antikörper), 1 % Rinderserumalbumin, 20 mM Tris/HCl, 1 mM DTT, 0,03 % Tween20, 0,01 mM Na3VO4). Nach 45-minütiger Inkubation bei rt werden die Platten in einem BMG PHERAstar Plattenlesegerät analysiert. In den Caliper Mobility Shift Assays werden Kinasereaktionen durch mikrofluidische Kapillarelektrophorese analysiert. Die Übertragung von Phosphat von ATP auf ein kurzes Peptid durch eine Kinase bewirkt eine Änderung der Nettoladung des Peptids um -2. Der Ladungsunterschied zwischen den unphosphorylierten und phosphorylierten Einheiten des Peptids kann in einem elektrischen Feld getrennt werden. Die Verwendung von Peptiden, die mit einer Fluoreszenzmarkierung verbunden sind, ermöglicht den Nachweis und die Quantifizierung beider Formen und damit die Berechnung des Reaktionsumsatzes. Für Dosis-Wirkungs-Messungen wird NVP-BHG712 in 90 % DMSO vorverdünnt und 50 nL-Aliquots der Lösung werden mit einem HummingBird-Nanodispenser direkt in die leere Assay-Platte gegeben. Die Kinasereaktionen werden durch Zugabe von 4,5 µL Substratmischung bestehend aus ATP und Peptidsubstrat in Assaypuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 0,02 % Rinderserumalbumin, 1 mM DTT, 0,02 % Tween20, 0,01 mM Na34, 10 mM Beta- Glycerophosphat) und 4,5 µL Enzymlösung in Assaypuffer. Die Peptidkonzentration beträgt in den Assays 2 µM. Die Konzentrationen für das Enzym sowie für MgCl2 und MnCl2 werden spezifisch auf den Bedarf des jeweiligen Enzyms abgestimmt. Die ATP-Konzentrationen werden an die Km-Werte des spezifischen Enzyms angepasst. Nach 60 Minuten Inkubation bei 30 °C werden die Kinasereaktionen durch Zugabe von 16 µL Stopplösung (100 mM HEPES pH 7,5, 5 % DMSO, 0,1 % Beschichtungsreagenz 10 mM EDTA pH 8,0, 0,015 % BRIJ35) gestoppt. Gestoppte Kinasereaktionen werden in einem LC3000-Reader analysiert.
Produktgruppe : Protein Tyrosinkinase > Ephrin-Rezeptor-Inhibitor
