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Biologische AktivitätMS436 weist eine niedrige nanomolare Affinität auf, wobei die erste Bromodomäne der zweiten vorgezogen wird. MS436 hemmt die BRD4-Aktivität bei der NF-κB-gerichteten Produktion von Stickoxid und dem proinflammatorischen Zytokin Interleukin-6 in Mausmakrophagen ohne signifikante Hemmung der Zelllebensfähigkeit.
Fluoreszenzanisotropie-Bindungsassay Die Bindungsaffinität der neu synthetisierten Diazobenzolverbindungen für verschiedene Bromodoamine wird in einem Fluoreszenzanisotropie-Kompetitionsassay unter Verwendung eines mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markierten MS417 als Assaysonde bestimmt. Kompetitionsexperimente werden mit einem BrD-Protein (0,25–1 µM) und der Fluoreszenzsonde (80 nM) und steigender Konzentration des unmarkierten konkurrierenden Liganden in einem PBS-Puffer (pH 7,4) in einem Gesamtvolumen von 80 µL durchgeführt Stunde Inkubation des fluoreszierenden Liganden und des Proteins bei 25°C mit Safire 2 Mikroplatten-Lesegerät. In einem kompetitiven Bindungsassay beträgt die Konzentration des fluoreszierenden Liganden 2 Kd und die Proteinkonzentration wurde eingestellt, bei der 50–80% des fluoreszierenden Liganden gebunden sind. Die Dissoziationskonstante eines konkurrierenden Liganden wird mit der von Nicolovska-Coleska und Kollegen eingeführten Korrektur der Cheng-Prussoff-Gleichung berechnet. Unter der Annahme eines kompetitiven Bindungsmodells an einer Stelle wird die Gleichung verwendet, um Kis aus IC50-Werten zu berechnen, die aus Anpassungsdaten unter Verwendung von Prism gewonnen wurden. Methode Murine Makrophagen-RAW264.7-Zellen werden mit einer Dichte von 10000 Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte ausplattiert und bei 37 °C für 18 h inkubiert. Die Zellen werden dann 24 Stunden lang mit den Diazobenzol-Bromodomänen-Inhibitoren bis zu 100 &mgr;l behandelt. Am Ende der 24-stündigen Inkubation werden 10 &mgr;l der MTT-Lösung (4 mg/ml) in jede Vertiefung gegeben und 4 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend werden die Überstände entfernt und die Zellen in 100 µl 100 % DMSO solubilisiert. Die Diazobenzolverbindungen werden zuerst in DMSO gelöst und dann mit Kulturmedium auf Konzentrationen im Bereich von 0,28 bis 50000 nM verdünnt. Die Endkonzentration von DMSO wird auf 0,05% (v/v) eingestellt. Das Ausmaß der Reduktion wird durch die Extinktion bei 570/630 nm unter Verwendung des EnVison 2104 Multilabel Reader gemessen.
Produktgruppe : Epigenetik > Epigenetischer Reader-Domänen-Inhibitor
