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Molekulargewicht:
310,35 TSU-68 (SU6668, Orantinib) hat die größte Potenz gegen PDGFR-Autophosphorylierung mit Ki von 8 nM, hemmt aber auch Flk-1 und FGFR1 trans-Phosphorylierung stark, wenig Aktivität gegen IGF-1R, Met, Src, Lck, Zap70, Abl und CDK2; hemmt EGFR nicht. Phase 3.
Biologische Aktivität TSU-68 ist ein kompetitiver Inhibitor in Bezug auf ATP, Flk-1/KDR-trans-Phosphorylierung, FGFR1-Trans-Phosphorylierung und PDGFRβ-Kinasen-Autophosphorylierung. TSU-68 (0,03–10 μM) hemmt die Tyrosinphosphorylierung von KDR in VEGF-stimulierten HUVECs. TSU-68 hemmt auch die PDGF-stimulierte PDGFR&bgr;-Tyrosin-Phosphorylierung in NIH-3T3-Zellen, die PDGFR&bgr; bei einer minimalen Konzentration von 0,03–0,1 &mgr;M überexprimieren. TSU-68 hemmt die durch saures FGF induzierte Phosphorylierung des FGFR1-Substrats 2 bei 10 μM und höher. TSU-68 (bis zu 100 μM) hat jedoch keine Wirkung auf die EGF-stimulierte EGFR-Tyrosin-Phosphorylierung in NIH-3T3-Zellen, die EGFR überexprimieren. TSU-68 hemmt die VEGF-getriebene und die FGF-getriebene Mitogenese von HUVECs mit einer mittleren IC50 von 0,34 µM bzw. 9,6 µM. In humanen myeloischen Leukämie-MO7E-Zellen hemmt TSU-68 die Tyrosin-Autophosphorylierung des Stammzellfaktor-(SCF)-Rezeptors, c-kit, mit einer IC50 von 0,1-1 µM, sowie die ERK1/2-Phosphorylierung, ein Signalereignis stromabwärts von c- Aktivierung des Kits. TSU-68 hemmt auch die SCF-induzierte Proliferation von MO7E-Zellen mit einer IC50 von 0,29 &mgr;M und induziert Apoptose. TSU-68 (75-200 mg/kg) induziert die Hemmung des Tumorwachstums gegen ein breites Spektrum von Tumortypen in Xenotransplantatmodellen bei athymischen Mäusen, einschließlich A375-, Colo205-, H460-, Calu-6-, C6-, SF763T- und SKOV3TP5-Zellen. TSU-68 (75 mg/kg) unterdrückt auch die Tumorangiogenese von C6-Gliom-Xenotransplantaten. In einem Tumormodell des menschlichen HT29-Kolonkarzinoms verringert TSU-68 (200 mg/kg) die durchschnittliche Gefäßpermeabilität und das durchschnittliche fraktionierte Plasmavolumen im Tumorrand und -kern. TSU-68 fördert eine abnormale Stromaentwicklung an der Peripherie von Karzinomen. In einem Kaninchen-VX2-Lebertumormodell verstärkt TSU-68 (200 mg/kg) die Wirkung einer chemotherapeutischen Infusion.
Trans-Phosphorylierungsreaktionen Tyrosinkinase-Assays zur Quantifizierung der trans-Phosphorylierungsaktivität von Flk-1 und FGFR1 werden in 96-Well-Mikrotiterplatten durchgeführt, die mit dem Peptidsubstrat vorbeschichtet sind (20 µg/Well in PBS; über Nacht bei 4 °C inkubiert) poly-Glu,Tyr (4:1). Überschüssige Proteinbindungsstellen werden mit 1-5% (w/v) BSA in PBS blockiert. Gereinigte GST-FGFR1 (Kinasedomäne) oder GST-Flk-1 (zytoplasmatische Domäne) Fusionsproteine werden dann in 2 × Konzentrations-Kinase-Verdünnungspuffer bestehend aus 100 mM HEPES, 50 mM NaCl, 40 μM NaVO4 und 0,02 . in die Mikrotiter-Wells gegeben % (Gew./Vol.) BSA. Die endgültige Enzymkonzentration für GST-Flk-1 und GST-FGFR1 beträgt 50 ng/ml. SU6668 wird in DMSO mit dem 100-fachen der erforderlichen Endkonzentration gelöst und 1:25 in H2O verdünnt. Anschließend werden 25 µl verdünntes SU6668 in jede Reaktionsvertiefung gegeben. Die Kinasereaktion wird durch Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen von ATP in einer MnCl2-Lösung initiiert, so dass die ATP-Endkonzentrationen den Km für das Enzym überspannen und die Endkonzentration von MnCl2 10 mM beträgt. Die Platten werden 5-15 min bei Raumtemperatur inkubiert, bevor die Reaktion durch Zugabe von EDTA gestoppt wird. Anschließend werden die Platten dreimal mit TBST gewaschen. Polyklonale Antiphosphotyrosin-Antiseren vom Kaninchen werden in einer Verdünnung von 1:10000 in TBST mit 0,5 % (w/v) BSA, 0,025 % (w/v) fettfreier Trockenmilch und 100 μM NaVO4 in die Vertiefungen gegeben und 1 Stunde bei 37 °C inkubiert C. Die Platten werden dann dreimal mit TBST gewaschen, gefolgt von der Zugabe von Ziegen-Anti-Kaninchen-Antiseren, die mit HRP konjugiert sind. Die Platten werden 1 Stunde bei 37 °C inkubiert und dann dreimal mit TBST gewaschen. Die Menge an Phosphotyrosin in jeder Vertiefung wird nach Zugabe von 2,2 quantifiziert
Methode
Die Zellen werden (3 × 105 Zellen/35-mm-Vertiefung) in DMEM mit 10 % (v/v) FBS ausgesät und wachsen bis zur Konfluenz und dann in DMEM, das 0,1% Serum enthält, für 2 Stunden vor der medikamentösen Behandlung ruhen gelassen. HUVECs (ausgesät auf 2 × 10 6 Zellen/10-cm-Platte) werden in Endothelzell-Wachstumsmedien bis zur Konfluenz gezüchtet und dann in Endothelzell-Basalmedien, die 0,5% FBS enthalten, 24 Stunden vor der Arzneimittelbehandlung ruhen gelassen. Alle Zelllinien werden mit SU6668 für 1 Stunde inkubiert, bevor die Ligandenstimulation (100 ng/ml) für 10 Minuten erfolgt.
Produktgruppe : Protein Tyrosinkinase > FLT3-Inhibitor
