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Molekulargewicht:
473,98 Pazopanib (GW786034) ist ein neuartiger Multi-Target-Inhibitor von VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, PDGFR, FGFR, c-Kit und c-Fms mit IC50 von 10 nM , 30 nM, 47 nM, 84 nM, 74 nM, 140 nM bzw. 146 nM.
Biologische Aktivität Pazopanib hemmt wirksam die VEGF-induzierte Phosphorylierung von VEGFR2 in HUVEC-Zellen mit einer IC50 von 8 nM. Pazopanib zeigt eine dosisabhängige Wachstumshemmung in allen Synovialsarkom-Zelllinien, einschließlich SYO-1- und HS-SY-II-Zellen. Die Proliferation von SYO-1- und HS-SY-II-Zellen wird bereits bei 1 µg/ml Pazopanib gehemmt und bei 5 µg/ml vollständig aufgehoben. Pazopanib induziert G1-Arrest und unterdrückt dadurch das Wachstum von Synovialsarkomzellen. Die Phosphorylierung von Akts, GSK-3β, JNKs, p70 S6 Kinase und mTOR wird in mit Pazopanib behandelten SYO-1-Zellen verglichen mit der in den mit Vehikel behandelten Zellen unterdrückt. Pazopanib zwischen 20 mg/ml und 22,5 mg/ml zeigt eine zunehmende Verringerung der Lebensfähigkeit der RPE-Zellen. Die mit 30 mg/kg oder 100 mg/kg Pazopanib behandelten Mäuse zeigten eine signifikante Verringerung der Tumorlast im Vergleich zu den mit Vehikel oder 10 mg/kg Pazopanib behandelten Mäusen. Die Behandlung mit Pazopanib wird gut vertragen und es gibt keinen signifikanten Unterschied im Körpergewicht zwischen den Mäusen in jeder Gruppe.
Kinase-Enzymassays VEGFR-Enzymassays für VEGGR1, VEGFR2 und VEGFR3 werden im homogenen zeitaufgelösten Fluoreszenz (HTRF)-Format in 384-Well-Mikrotiterplatten unter Verwendung eines gereinigten, Baculovirus-exprimierten Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsproteins durchgeführt kodiert für den katalytischen C-Terminus der humanen VEGFR-Rezeptorkinasen 1, 2 oder 3. Reaktionen werden durch Zugabe von 10 µl aktivierter VEGFR2-Kinaselösung [Endkonzentration, 1 nM Enzym in 0,1 M HEPES, pH 7,5, mit 0,1 mg /ml Rinderserumalbumin (BSA), 300 μM Dithiothreitol (DTT)] auf 10 μL Substratlösung [Endkonzentration, 360 nM Peptid, (Biotin-Aminohexyl-EEEEYFELVAKKKK-NH2), 75 μM ATP, 10 μM MgCl2] und 1 μL titriertes Pazopanib in DMSO. Die Platten werden 60 min bei Raumtemperatur inkubiert, und dann wird die Reaktion durch die Zugabe von 20 &mgr;l 100 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gequencht. Nach dem Quenchen werden 20 μL HTRF-Reagenzien (Endkonzentration, 15 nM Streptavidin-gebundenes Allophycocyanin, 1 nM Europium-markierter Antiphosphotyrosin-Antikörper, verdünnt in 0,1 mg/ml BSA, 0,1 M HEPES, pH 7,5) zugegeben und die Platten für mindestens 10 Minuten. Die Fluoreszenz bei 665 nM wird mit einem Wallac Victor Plattenlesegerät mit einer Zeitverzögerung von 50 µs gemessen.
Methode
Die Phosphorylierung von VEGFR2 wird in HUVEC untersucht, die mit VEGF stimuliert wurden. HUVEC werden in kollagenbeschichteten 10 cm-Platten vom Typ I in Clonetics EGM-MV-Medium mit 1,0-1,5 × 10 6 Zellen/Platte ausplattiert. Nach 24 Stunden werden die konfluenten Zellen über Nacht mit Serum ausgehungert, indem das Wachstumsmedium durch Clonetics EBM-Medium ersetzt wird, das 0,1% BSA, 500 &mgr;g/ml Hydrocortison enthält. Die Zellen werden mit Pazopanib in verschiedenen Konzentrationen 1 Stunde lang behandelt, gefolgt von der Zugabe von 10 ng/ml VEGF oder Vehikel für 10 Minuten. Zellen werden in Lysepuffer solubilisiert. VEGFR2 wird mit antiflk-1-Antikörper immunpräzipitiert und durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert, gefolgt von Western-Blotting und Detektion mit antiflk-1 oder mit antiphosphotyrosin (anti-P-tyr-biotin)-Antikörper. Der VEGFR2-Phosphorylierungsspiegel wird durch Densitometrie quantifiziert und auf den Gesamt-VEGFR2-Spiegel normalisiert.
Produktgruppe : Protein Tyrosinkinase > FLT3-Inhibitor
