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Molekulargewicht:
379.459 LAQ824 (Dacinostat) ist ein neuartiger HDAC-Inhibitor mit einem IC50 von 32 nM und ist dafür bekannt, den p21-Promotor zu aktivieren.
Biologische Aktivität LAQ824 aktiviert die Expression von das Gen, das den p21-Zellzyklus-Inhibitor codiert, durch Aktivieren des p21-Promotors mit 50% der maximalen Promotoraktivierung (AC50) von 0,30 &mgr;M. LAQ824 hemmt das Zellwachstum sowohl von H1299, einer nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom-Zelllinie, als auch HCT116, einer Dickdarmkrebs-Zelllinie mit einer IC50 von 0,15 μM bzw. 0,01 μM, und die antiproliferative Wirkung von LAQ824 ist selektiv gegenüber den Tumorzelllinien während bei normalen Fibroblasten nur ein Wachstumsstillstand induziert wird. Darüber hinaus induziert LAQ824 einen dosisabhängigen Anstieg des p21-Proteins in A549-Zellen und einen Anstieg des hypophosphorylierten Zustands des Rb-Tumorsuppressors. Eine aktuelle Studie zeigt, dass LAQ824 Chromatinveränderungen auf der Ebene des IL-10-Genpromotors induziert, die zu einer verstärkten Rekrutierung der Transkriptionsrepressoren HDAC11 und PU.1 führen und die IL-10-Produktion in BALB/c-Mäusemakrophagen hemmen. Bei HCT116 und humanen Kolontumor-Xenotransplantaten in Nacktmäusen erzeugt die LAQ824-Behandlung mit 100 mg/kg die hemmende Wirkung auf das Tumorwachstum in einem dosisabhängigen Modus ohne allgemeine Zytotoxizität.
In-vitro-Histon-Deacetylase-Assay HDAC-Enzyme werden teilweise aus H1299-Zelllysat durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung der Q Sepharose Fast Flow-Säule gereinigt. Enzymkomplexe werden aus 500 mg Gesamtzelllysat durch Immunpräzipitation mit polyklonalem cdk2-Antikörper oder monoklonalem cdk1-cdc2-Antikörper gesammelt. Immunpräzipitate werden in Kinasepuffer (50 mM Hepes, pH 8, 10 mM MgCl2, 2,5 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol, 20 mM ATP, 10 mM β-Glycerophosphat, 0,1 mM NaVO4, 1 mM Natriumfluorid, 50 mM ATP, 10 .) resuspendiert μCi [γ-32P]ATP) zusammen mit 1 μg rekombinantem Proteinsubstrat pRb (cdk2) oder 10 ml H1-Histonmischung mit 20 μg Substrat (cdc2). Phosphoryliertes Rb- und H1-Histon werden durch Elektrophorese aufgetrennt und unter Verwendung eines PhosphorImager quantifiziert.
Methode Die Zellproliferation wird unter Verwendung einer Anpassung veröffentlichter Verfahren gemessen (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfonyl)-2H-tetrazolium-Assay ). Die Zellen werden in 12-Well-Schalen ausgesät und in RPMI 1640, das 10 % FBS enthält, kultiviert. Die Zellen werden in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von TSA (bis zu 1.000 ng/ml) kultiviert. Um die Wachstumshemmung durch TSA zu untersuchen, wird die Zahl der lebensfähigen Zellen durch Ausschluss von Trypanblau-Farbstoff bestimmt und in einem Hämozytometer vom Nesbauer-Typ für 0 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden gezählt. Dem RPMI 1640-Medium wird die gleiche Menge Ethanol wie im Kontrollexperiment zugesetzt. Alle Experimente werden doppelt durchgeführt und dreimal wiederholt. Der durchschnittliche Hintergrundwert (Behandlung mit Medium allein) wird von jeder experimentellen Vertiefung abgezogen; Dreifachwerte werden für jede Verbindungsverdünnung gemittelt. Die folgenden Formeln werden verwendet, um den Wachstumsprozentsatz zu berechnen: Wenn X0, %Wachstum=(X-T0)/T0*100; Wenn X>T0, %Wachstum=(X-T0)/(GC-T0)*100. wobei T0 der Durchschnittswert von T0 – Hintergrund ist, GC der Durchschnittswert von unbehandelten Zellen (in dreifacher Ausführung) – Hintergrund ist und X der Durchschnittswert von verbindungsbehandelten Zellen (in dreifacher Ausführung) – Hintergrund ist. Das [% Wachstum" wird gegen die Verbindungskonzentration aufgetragen und verwendet, um die IC50 unter Verwendung der linearen Regressionstechniken zwischen den Datenpunkten zu berechnen, um die Konzentration der Verbindungen bei 50% Hemmung vorherzusagen.
Produktgruppe : Epigenetik > HDAC-Inhibitor
