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Molekulargewicht:
567,01 AC480 (BMS-599626) ist ein selektiver und wirksamer Inhibitor von HER1 und HER2 mit einer IC50 von 20 nM und 30 nM, ~8-mal weniger wirksam als HER4, >100-fach gegenüber VEGFR2, c-Kit, Lck, MET usw. Phase 1.
Biologische Aktivität BMS-599626 hemmt auch den verwandten Rezeptor HER4, jedoch mit reduzierter Wirksamkeit mit IC50 von 190 nM. BMS-599626 wird als ATP-kompetitiver Inhibitor für HER1 und als ATP-nichtkompetitiver Inhibitor für HER2 mit Ki von 2 nM bzw. 5 nM identifiziert. BMS-599626 hemmt die Proliferation von Tumorzellen, die hohe Mengen an HER1 und/oder HER2 exprimieren, einschließlich Sal2, BT474, N87, KPL-4, HCC202, HCC1954, HCC1419, AU565, ZR-75-30, MDA-MB-175, GEO- und PC9-Zellen mit IC50 von 0,24 µM, 0,31 µM, 0,45 µM, 0,38 µM, 0,94 µM, 0,34 µM, 0,75 µM, 0,63 µM, 0,51 µM, 0,84 µM, 0,90 µM bzw. 0,34 µM. Während die Proliferation der Ovarialtumorzelllinie A2780 und MRC5-Fibroblasten, von denen keiner HER1 oder HER2 exprimiert, durch BMS-599626 nicht signifikant gehemmt wird. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigt, dass BMS-599626 die Strahlenempfindlichkeit von HN-5-Zellen, die sowohl EGFR- als auch Her2-Zellen exprimieren, signifikant erhöht, indem es die Umverteilung des Zyklus fördert und die DNA-Reparatur hemmt. In vivo führt die orale Verabreichung von BMS-599626 zu einer dosisabhängigen Hemmung des Sal2-Tumorwachstums bei Dosen von 60 mg/kg bis 240 mg/kg, was eine starke Antitumoraktivität in einem menschlichen Brusttumor KPL-4-Xenotransplantat bei seiner maximal verträgliche Dosis von 180 mg/kg und weist auch eine ähnliche Antitumoraktivität in anderen HER2-amplifizierten Xenotransplantatmodellen sowie anderen HER1-überexprimierenden Xenotransplantatmodellen auf.
Proteinkinase-Assays Die gesamten zytoplasmatischen Sequenzen von HER1, HER2 und HER4 werden als rekombinante Proteine in Sf9-Insektenzellen exprimiert. HER1 und HER4 werden als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase exprimiert und durch Affinitätschromatographie an Glutathion-S-Sepharose gereinigt. HER2 wird in den pBlueBac4-Vektor subkloniert und unter Verwendung eines internen Methionin-Codons (M687) zur Translationsinitiation als nicht markiertes Protein exprimiert. Das verkürzte HER2-Protein wird durch Chromatographie an einer DEAE-Sepharose-Säule isoliert, die in einem Puffer äquilibriert ist, der 0,1 M NaCl enthält, und das rekombinante Protein wird mit einem Puffer eluiert, der 0,3 M NaCl enthält. Für die HER-Kinase-Assays betragen die Reaktionsvolumina 50 μL und enthalten 10 ng Glutathion-S-Transferase-Fusionsprotein oder 150 ng teilweise gereinigtes HER2. Die Mischungen enthalten außerdem 1,5 µM Poly(Glu/Tyr) (4:1), 1 µM ATP, 0,15 µCi [γ-33P]ATP, 50 mM Tris-HCl (pH 7,7), 2 mM DTT, 0,1 mg/ml Rinder Serumalbumin und 10 mM MnCl2. Die Reaktionen werden 1 Stunde bei 27 °C ablaufen gelassen und durch die Zugabe von 10 μl Stopppuffer (2,5 mg/ml Rinderserumalbumin und 0,3 M EDTA) gefolgt von einer 108-μl-Mischung von 3,5 mM ATP . beendet und 5% Trichloressigsäure. Säureunlösliche Proteine werden auf GF/C Unifilter-Platten mit einem Filtermate-Harvester gewonnen. Der Einbau von radioaktivem Phosphat in das Poly(Glu/Tyr)-Substrat wird durch Flüssigszintillationszählung bestimmt. Die prozentuale Hemmung der Kinaseaktivität wird durch nichtlineare Regressionsanalysen bestimmt und die Daten werden als die Hemmkonzentration angegeben, die erforderlich ist, um eine 50%ige Hemmung relativ zu den Kontrollreaktionen (IC50) zu erreichen. Die Daten sind die Mittelwerte von Dreifachbestimmungen. Alle anderen Tyrosinkinasen werden ebenfalls unter Verwendung von Poly(Glu/Tyr) als Substrat getestet. Die Kinetik der HER1- und HER2-Hemmung wird in Reaktionsmischungen bestimmt, die unterschiedliche Konzentrationen von ATP und BMS-599626 enthalten.
Methode Alle Zelllinien werden in RPMI 1640 gehalten, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin. Die Zellen werden zu 1.000 pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und 24 Stunden lang kultiviert, bevor BMS-599626 zugegeben wird. BMS-599626 wird in Kulturmedium verdünnt, so dass die Endkonzentrationen von DMSO ≤ 1% betragen. Nach der Zugabe von BMS-599626 werden die Zellen weitere 72 Stunden kultiviert, bevor die Lebensfähigkeit der Zellen durch Messung der Umwandlung von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-Farbstoff mit dem CellTiter96-Kit. Bei einigen Zelllinien fehlt eine Korrelation zwischen dem Stoffwechsel von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-Farbstoff und der Zellzahl, und ein Thymidin-Aufnahme-Assay wird verwendet, um die Proliferation von . zu messen diese Zelllinien. Zellen werden in 96-Well-Platten ausplattiert und mit Verbindungen wie oben behandelt. Am Ende der 72-stündigen Inkubation werden die Zellen 3 Stunden lang mit [3H]Thymidin (0,4 µCi/Well) gepulst, bevor sie geerntet werden. Die Zellen werden mit 2,5% Trypsin für 10 Minuten bei 37 °C verdaut und durch Filtration unter Verwendung eines Packard Filtermate Harvester und GF/C Unifilter-Platten geerntet. Der Einbau von radioaktivem Thymidin in Nukleinsäuren wird durch Flüssigszintillationszählung bestimmt.
Produktgruppe : Protein Tyrosinkinase > HER2-Inhibitor
