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Molekulargewicht:
340,38 NVP-BVU972 ist ein selektiver und potenter Met-Inhibitor mit einer IC50 von 14 nM.
Biologische Aktivität NVP-BVU972 hemmt stark die MET-Kinase, zeigt jedoch eine geringe Hemmung gegenüber anderen Kinasen einschließlich der am engsten verwandten Kinase RON mit IC50-Werten von mehr als 1000 nM. NVP-BVU972 unterdrückt auch die konstitutive MET-Phosphorylierung in GTL-16-Zellen oder die HGF-stimulierte MET-Phosphorylierung in A549-Zellen mit IC50-Werten von 7,3 nM bzw. 22 nM. NVP-BVU972 verhindert wirksam das Wachstum der MET-Gen-amplifizierten Zelllinien GTL-16, MKN-45 und EBC-1 mit IC50-Werten von 66 nM, 82 nM bzw. 32 nM. Entsprechend ihrer hohen Häufigkeit im NVP-BVU972-Screening führen Y1230- und D1228-Mutationen zu dramatischen Verschiebungen der gemessenen IC50-Werte für NVP-BVU972 in der BaF3-Zelllinie. Der von V1155L ausgelöste Widerstand ist stärker auf NVP-BVU972 beschränkt. Eine dosisabhängige Verringerung der TPR-MET-Phosphorylierung bei Anwendung von NVP-BVU972 auf BaF3-Zellen, die Wildtyp-TPR-MET exprimieren. Sowohl die Y1230H- als auch die D1228A-Mutationen hoben die Wirkung von NVP-BVU972 auf, nicht jedoch AMG 458. F1200I und L1195V beeinträchtigen jedoch die Wirksamkeit von NVP-BVU972, um die TPR-MET-Phosphorylierung zu verhindern.
Biochemischer TR-FRET-Assay mit MET-Wildtyp und Mutanten Die Enzymaktivität wird in einem zeitaufgelösten Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (TR-FRET)-Assay gemessen, der die Tyrosinphosphorylierung mit einem Eu-markierten Anti-Phospho-Tyrosin-Antikörper (Fluoreszenz-Donor) detektiert und Allophycocyanin, konjugiert an Streptavidin (Fluoreszenzakzeptor), das an ein Biotin auf dem Substratpeptid bindet. Für jede Variante werden Km-Konzentrationen für ATP in Abwesenheit von NVP-BVU972 bestimmt und die ATP-Konzentration in der Kinasereaktion wird auf Km (4 μM für MET wt, 1 μM für MET Y1230H und MET F1200I) eingestellt. NVP-BVU972 wird in DMSO gelöst und verdünnt und vierfach getestet. Kinasereaktionen werden in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 8 mM MgCl2, 4 mM MnCl2, 0,05 % Tween 20, 0,05 % Rinderserumalbumin, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 mM Na3VO4, in weißen 1536-Well-Platten durchgeführt bei Raumtemperatur. NVP-BVU972 und Enzym werden in einem Volumen von 2 µL für 20 min inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 1 µL ATP und 1 µL biotinyliertem Peptidsubstrat (PTK1) bis zu Endkonzentrationen von Km bzw. 1 µM. Die Enzymkonzentrationen in den Reaktionen betragen 5 nM für MET wt und 4 nM für die Varianten F1200I und Y1230H. Nach 90 Minuten werden die Reaktionen durch Zugabe von 1 μl Stopp-/Nachweislösung gestoppt, um Endkonzentrationen von 10 mM EDTA, 3,5 nM Eu-markiertem Antiphospho-Tyrosin-Antikörper PY20 und 10 nM Streptavidin Allophycocyanin zu erreichen. Der zeitaufgelöste Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer wird in einem Envision-Plattenleser gemessen (Anregung 320 nm, Emission 615 nm und 665 nm).
Methode BaF3-Zellen, die TPR-MET oder verschiedene Mutanten davon enthalten, werden in RPMI 1640-Medium mit 10 % fötalem Kälberserum gezüchtet. Zur Erhaltung der parentalen BaF3-Zellen wird das Medium zusätzlich mit 10 ng/ml Interleukin-3 (IL-3) ergänzt. Für Proliferationsassays werden BaF3-Zellen auf 96-Well-Platten in Triplikaten mit 104 Zellen pro Well ausgesät und mit verschiedenen Konzentrationen von NVP-BVU972 72 Stunden lang inkubiert, gefolgt von der Quantifizierung lebensfähiger Zellen unter Verwendung einer Resazurin-Natriumsalz-Farbreduktionsanzeige. IC50-Werte werden mit dem XLFit Excel Add-In unter Verwendung eines 4-Parameter-Dosis-Wirkungs-Modells bestimmt.
Produktgruppe : Protein Tyrosinkinase > HER2-Inhibitor
