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Molekulargewicht: 465,54 KU-0063794 ist ein potenter und hochspezifischer Dual-mTOR-Inhibitor von mTORC1 und mTORC2 mit IC50 von ~10 nM; keine Wirkung auf PI3Ks.
Im Vergleich zum mTOR-Inhibitor PP242 weist KU-0063794 eine höhere Spezifität für mTOR auf, da es gegenüber PI3Ks oder 76 anderen Kinasen inaktiv ist. In HEK-293-Zellen reicht KU-0063794 bei 30 nM aus, um die S6K1-Aktivität durch Blockieren der Phosphorylierung des hydrophoben Motivs (Thr389) und anschließend der Phosphorylierung des T-Loop-Rests (Thr229) schnell abzubauen. Im Falle einer IGF1-Stimulation von Serum-hungrigen HEK-293-Zellen werden 300 nM KU-0063794 benötigt, um die S6K1-Aktivität um ~90% zu hemmen. KU-0063794 bei 100-300 nM hemmt auch vollständig die Aminosäure-induzierte Phosphorylierung von S6K1- und S6-Protein. Ähnlich wie S6K1 hemmt KU-0063794 dosis- und zeitabhängig die Phosphorylierung von mTORC1 an Ser2448 und mTORC2 an Ser2481. In Anwesenheit von Serum oder nach IGF1-Stimulation induziert KU-0063794 eine dosisabhängige Hemmung der Aktivität und Phosphorylierung von Akt an Ser473 und unerwartetem Thr308 sowie die Phosphorylierung der Akt-Substrate PRAS40 an Thr246, GSK3α/GSK3β an Ser21/ Ser9 und Foxo-1/3a bei Thr24/Thr32. KU-0063794, aber nicht Rapamycin hemmt die SGK1-Aktivität und die Ser422-Phosphorylierung sowie sein physiologisches Substrat NDGR1 dosisabhängig im gleichen Ausmaß wie die S6K1- und Akt-Phosphorylierung, während KU-0063794 die Phorbolester-induzierte ERK- oder RSK-Phosphorylierung nicht hemmt und RSK-Aktivierung. Im Vergleich zu Rapamycin weist KU-0063794 eine signifikantere Wirksamkeit auf, um die vollständige Dephosphorylierung von 4E-BP1 bei Thr37, Thr46 und Ser65 zu induzieren. KU-0063794 hemmt das Zellwachstum sowohl von Wildtyp- als auch von mLST8-defizienten MEFs und induziert einen G1-Zellzyklusarrest, signifikanter als Rapamycin.
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mTOR complexes kinase assays
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HEK-293 cells are freshly lysed in Hepes lysis buffer. Lysate (1-4 mg) is pre-cleared by incubating with 5-20 μL of Protein G-Sepharose conjugated to pre-immune IgG. The lysate extracts are then incubated with 5-20 μL of Protein G-Sepharose conjugated to 5-20 μg of either anti-Rictor or anti-Raptor antibody, or pre-immune IgG. All antibodies are covalently conjugated to Protein G-Sepharose. Immunoprecipitations are carried out for 1 hour at 4 °C on a vibrating platform. The immunoprecipitates are washed four times with Hepes lysis buffer, followed by two washes with Hepes kinase buffer. For Raptor immunoprecipitates used for phosphorylating S6K1, for the initial two wash steps the buffer includes 0.5 M NaCl to ensure optimal kinase activity. GST-Akt1 is isolated from serum-deprived HEK-293 cells incubated with PI-103 (1 μM for 1 hour). GST-S6K1 is purified from serum-deprived HEK-293 cells incubated with rapamycin (0.1 μM for 1 hour). mTOR reactions are initiated by adding 0.1 mM ATP and 10 mM MgCl2 in the presence of various concentrations of KU-0063794 and GST-Akt1 (0.5 μg) or GST-S6K1 (0.5 μg). Reaction are carried out for 30 minutes at 30 °C on a vibrating platform and stopped by addition of SDS sample buffer. Reaction mixtures are then filtered through a 0.22-μm-poresize Spin-X filter and samples are subjected to electrophoresis and immunoblot analysis with the indicated antibodies.
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Zellassay: [1]
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Cell lines
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Wild-type and mLST8 deficient MEFs
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Concentrations
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Dissolved in DMSO, final concentration ~3 μM
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Incubation Time
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24, 48, and 72 hours
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Method
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Cells are treated with KU-0063794 for 24, 48, and 72 hours, and the medium is changed every 24 hours with freshly dissolved KU-0063794. For the measurement of cell growth, cells are washed once with PBS, and fixed in 4% (v/v) paraformaldehyde in PBS for 15 minutes. After washing once with water, the cells are stained with 0.1% Crystal Violet in 10% ethanol for 20 minutes and washed three times with water. Crystal Violet is extracted from cells with 0.5 mL of 10% (v/v) ethanoic (acetic) acid for 20 minutes. The eluate is then diluted 1:10 in water and absorbance at 590 nm is quantified. For the assessment of cell cycle distribution, cells are harvested by trypsinization, washed once in PBS, and re-suspended in ice-cold aq. 70% (v/v) ethanol. Cells are washed twice in PBS plus 1% (w/v) BSA and stained for 20 minutes in PBS plus 0.1% (v/v) Triton X-100 containing 50 g/mL propidium iodide and 50 g/mL RNase A. The DNA content of cells is determined using a FACSCalibur flow cytometer and CellQuest software. Red fluorescence (585 nm) is acquired on a linear scale, and pulse width analysis is used to exclude doublets. Cell-cycle distribution is determined using FlowJo software.
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Umrechnung verschiedener Modelltiere basierend auf BSA (Wert basierend auf Daten aus FDA Draft Guidelines)
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Species
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Baboon
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Dog
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Monkey
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Rabbit
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Guinea pig
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Rat
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Hamster
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Mouse
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Weight (kg)
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12
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10
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3
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1.8
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0.4
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0.15
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0.08
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0.02
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Body Surface Area (m2)
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0.6
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0.5
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0.24
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0.15
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0.05
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0.025
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0.02
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0.007
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Km factor
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20
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20
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12
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12
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8
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6
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5
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3
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Animal A (mg/kg) = Animal B (mg/kg) multiplied by
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Animal B Km
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Animal A Km
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Um beispielsweise die Resveratrol-Dosis für eine Maus (22,4 mg/kg) auf eine Dosis basierend auf dem BSA für eine Ratte zu ändern, multiplizieren Sie 22,4 mg/kg mit dem Km-Faktor für eine Maus und dividieren Sie dann durch den Km-Faktor für eine Ratte. Diese Berechnung ergibt eine Ratten-Äquivalentdosis für Resveratrol von 11,2 mg/kg.
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Rat dose (mg/kg) = mouse dose (22.4 mg/kg) ×
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mouse Km(3)
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= 11.2 mg/kg
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rat Km(6)
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Chemische Informationen
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Molecular Weight (MW)
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465.54
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Formula
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C25H31N5O4
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CAS No.
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938440-64-3
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Storage
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3 years -20℃Powder
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6 months-80℃in solvent (DMSO, water, etc.)
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Synonyms
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Solubility (25°C) *
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In vitro
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DMSO
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16 mg/mL
(34.36 mM)
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Water
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<1 mg/mL
(
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Ethanol
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<1 mg/mL
(
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In vivo
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30% PEG400/0.5% Tween80/5% propylene glycol
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30 mg/mL
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* <1 mg/ml means slightly soluble or insoluble.
* Please note that Selleck tests the solubility of all compounds in-house, and the actual solubility may differ slightly from published values. This is normal and is due to slight batch-to-batch variations.
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Chemical Name
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(5-(2-((2R,6S)-2,6-dimethylmorpholino)-4-morpholinopyrido[2,3-d]pyrimidin-7-yl)-2-methoxyphenyl)methanol
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Molaritätsrechner Verdünnungsrechner Molekulargewichtsrechner
Produktgruppe : PI3K/Akt/mTOR > mTOR-Inhibitor
