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Molekulargewicht:
319,36 PP-121 ist ein mehrfach zielgerichteter Inhibitor von PDGFR, Hck, mTOR, VEGFR2, Src und Abl mit IC50 von 2 nM, 8 nM, 10 nM, 12 nM, 14 nM und 18 nM, hemmt auch DNA-PK mit IC50 von 60 nM.
Biologische Aktivität Die PP-121-Selektivität interagiert innerhalb einer hydrophoben Tasche, die zwischen Tyrosinkinasen und PI3Ks konserviert ist, nicht Serin-Threonin-Kinasen. PP-121 bildet in Src eine Wasserstoffbrücke zu Glu310, wodurch die strukturelle Rolle des katalytischen Lysins effektiv ersetzt wird und zur Ordnung der Helix C und zur Stabilisierung einer aktiven Konformation führt. PP-121 hemmt auch andere PI3Ks, einschließlich p110α und DNA-PK mit IC50 von 52 nM bzw. 60 nM. PP-121 blockiert wirksam und dosisabhängig die Phosphorylierung von Akt, p70S6K und S6 in zwei Glioblastom-Zelllinien, U87 und LN229. PP-121 hemmt die Proliferation einer Untergruppe der Tumorzelllinien durch direkte Hemmung von PI3Ks und mTOR. PP-121 induziert einen G0/G1-Arrest in LN220-, U87- und Seg1-Zellen. PP-121 blockiert auch die durch v-Src induzierte Tyrosinphosphorylierung in NIH3T3-Zellen, die mit v-Src(Thr338) transformiert wurden. PP-121 könnte die Aktin-Stress-Faserfärbung in mit v-Src(Thr338) transformierten NIH3T3-Zellen wiederherstellen. PP-121 in einer niedrigen Konzentration von 40 nM hemmt die Ret-Autophosphorylierung in TT-Schilddrüsenkarzinomzellen, die die onkogene C634W-Ret-Mutante35 exprimieren. PP-121 hemmt die Zellproliferation mit einer IC50 von 50 nM in TT-Schilddrüsenkarzinomzellen. PP-121 hemmt die Zellproliferation, die nur mit VEGF mit einem IC50 von 41 nM in menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) stimuliert wird. PP-121 hemmt direkt die Bcr-Abl-induzierte Tyrosinphosphorylierung, was zu einer arzneimittelinduzierten Apoptose in K562-Zellen und einer Kombination von Apoptose und Zellzyklusarrest in Bcr-Abl-exprimierenden BaF3-Zellen führt.
Kinase-Assays Gereinigte Kinase-Domänen werden mit PP-121 in 2- oder 4-facher Verdünnung über einen Konzentrationsbereich von 1 nM-50 µM oder mit Vehikel (0,1% DMSO) in Gegenwart von 10 µM ATP, 2,5 µCi von γ . inkubiert -32P-ATP und Substrat. Die Reaktionen werden je nach Substrat durch Auftropfen auf Nitrozellulose- oder Phosphozellulosemembranen beendet; diese Membran wird dann 5–6 mal gewaschen, um ungebundene Radioaktivität zu entfernen, und getrocknet. Die übertragene Radioaktivität wird durch Phosphorimaging quantifiziert, und die IC50-Werte werden durch Anpassen der Daten an eine sigmoidale Dosisreaktion unter Verwendung der Prism-Software berechnet.
Methode Für die Western-Blot-Analyse werden Zellen in 12-Well-Platten gezüchtet und mit PP-121 in den angegebenen Konzentrationen oder Vehikel (0,1% DMSO) behandelt. Behandelte Zellen werden lysiert, Lysate werden durch SDS-PAGE aufgelöst, auf Nitrozellulose übertragen und geblottet. Für Zellproliferationsassays werden Zellen in 96-Well-Platten gezüchtet und mit PP-121 in 4-facher Verdünnung (10 &mgr;M – 0,040 &mgr;M) oder Vehikel (0,1% DMSO) behandelt. Nach 72 Stunden werden die Zellen Resazurin-Natriumsalz (22 uM) ausgesetzt und die Fluoreszenz wird quantifiziert. IC50-Werte werden mit der Prism-Software berechnet. Für Proliferationsassays mit Einzelzellzählung werden nicht-adhärente Zellen mit geringer Dichte (3–5% Konfluenz) ausplattiert und mit PP-121 (2,5 µM) oder Vehikel (0,1% DMSO) behandelt. Die Zellen werden täglich in Trypanblau verdünnt und die lebensfähigen Zellen werden unter Verwendung eines Hämozytometers gezählt. Zur Apoptose- und Zellzyklusanalyse werden die Zellen 24–72 Stunden lang mit der angegebenen Konzentration von PP-121 oder Vehikel (0,1% DMSO) behandelt. Zellen werden entweder live mit AnnexinV-FITC gefärbt oder mit Ethanol fixiert und mit Propidiumiodid gefärbt. Zellpopulationen werden unter Verwendung eines FacsCalibur-Durchflusszytometers getrennt; Daten werden mit der CellQuest Pro Software gesammelt und entweder mit ModFit oder FlowJo Software analysiert.
Produktgruppe : Protein Tyrosinkinase > PDGFR-Inhibitor
